Em fins de 1554, o soberano ordenou, ao seu principal ministro, Gaspar II de Coligny (ainda católico à época), a preparação de uma expedição sigilosa ao Brasil, cujo comando entregou a Villegagnon. Embora tenha fornecido recursos modestos (apenas 10 000 libras), os armadores de Dieppe (base do armador Jean Ango, experiente com a costa brasileira), decidiram investir na expedição. À falta de voluntários para integrá-la, Villegagnon percorreu as prisões da região norte da França, prometendo a liberdade a quem quer que se lhe juntasse. Para não despertar a atenção do Ministro de Portugal na França, Villegagnon fez espalhar a notícia de que a expedição se dirigia à costa da Guiné.