Em Espanha, onde viveu quatro anos, lutou ao serviço do Imperador Carlos V contra os franceses. No inverno de 1525, Martim Afonso teve uma participação destacada no cerco e tomada de Fuenterrábia, cidade próxima a Pamplona, na província de Navarra, no noroeste da Espanha. O imperador elogiou-o publicamente e o convidou para permanecer em Castela.